今天讓我們一起來(lái)了解一下合成多肽分析鑒定方法有哪些吧
 

　　多肽的分析鑒定方法有多肽一級(jí)結(jié)構(gòu)，二級(jí)結(jié)構(gòu)鑒定，多肽一級(jí)結(jié)構(gòu)包括：質(zhì)譜分析，氨基酸組成分析，氨基酸序列分析。二級(jí)結(jié)構(gòu)包括：圓二色譜(CD)，NMR，X-衍射等方法。
 

　　一、純度分析
 

　　多肽的純度分析，一般都采用HPLC進(jìn)行分析，選擇RP-C18，粒徑5μm，孔徑300A，4.6×150mm，流動(dòng)相：A，0.1% TFA/H2O;B，0.1% TFA/ACN，洗脫梯度，5%B--65%B，時(shí)間30min。也有些多肽，特別是短肽，由于親水性強(qiáng)，在C18上保留很弱，需要改變條件，這里主要有兩種方法：一個(gè)改變分析梯度，可以將起始梯度改為2%，等度或小梯度洗脫;另外一個(gè)方法是在流動(dòng)相中加入強(qiáng)離子對(duì)試劑，如七氟丁酸，十八烷基磺酸鈉等。
 

　　二、一級(jí)結(jié)構(gòu)分析
 

　　1.質(zhì)譜分析
 

　　質(zhì)譜分析的目的主要是確證分子量，當(dāng)然采用MS/MS可以部分的了解多肽序列的信息，但是這個(gè)需要比較全的數(shù)據(jù)庫(kù)作為基礎(chǔ)，分析才能比較準(zhǔn)確。由于多肽性質(zhì)不穩(wěn)定，需要采用軟電離技術(shù)，目前多肽分析主要使用了電噴霧(ESI-MS)，基質(zhì)輔助激光解吸(MALDI-MS)。
 

　　其中ESI-MS通常會(huì)給出多電荷峰，電荷數(shù)目和多肽序列上氨基，胍基，咪唑基的數(shù)目有關(guān)，因此，經(jīng)常給出了雙電荷，三電荷等離子峰。
 

　　MALDI-MS可以分析蛋白大分子，而且通常情況下很少帶多電荷，因此數(shù)據(jù)直接對(duì)應(yīng)了分子離子峰，容易分析。此外，通常在分析長(zhǎng)肽或蛋白過(guò)程中，需要添加NH4，Na，K等離子，提高靈敏度，所以一般在MS中出現(xiàn)一組峰，分別對(duì)應(yīng)：(M+H)+，(M+NH4)+，(M+Na)+，(M+K)+。
 

　　2.氨基酸組成分析
 

　　氨基酸組成分析一般需要產(chǎn)品的純度較高，它可以給出多肽中氨基酸的種類，數(shù)目。分析過(guò)程首先通過(guò)酸水解破壞肽鍵，典型酸水解的條件是：真空條件下，110℃，用6M鹽酸水解16至72小時(shí)。
 

　　酸水解雖然很有用，但酸水解條件下不能獲得完整的氨基酸分析，因?yàn)樘於０泛凸劝滨０返膫?cè)鏈含有酰胺鍵，用于切斷蛋白質(zhì)肽鍵的酸也可以將天冬酰胺轉(zhuǎn)換為天冬氨酸，谷氨酰胺轉(zhuǎn)換為谷氨酸。由于水解溫度比較高，色氨酸的吲哚環(huán)容易被空氣氧化，即使在密封的管中，色氨酸的吲哚環(huán)也幾乎都被破壞了。
 

　　因此蛋白質(zhì)的色氨酸含量往往是通過(guò)它的紫外吸收光譜估計(jì)的，也可以通過(guò)堿水解分析色氨酸的含量。半胱氨酸在酸水解中也不能準(zhǔn)確測(cè)定，要準(zhǔn)確測(cè)量需要在蛋白質(zhì)水解之前進(jìn)行氧化或羧甲基化，形成的衍生物在酸水解之后才能定量。
 

　　3.氨基酸序列分析
 

　　氨基酸序列分析的基本原理是Edman降解，主要涉及耦聯(lián)、水解、萃取和轉(zhuǎn)換等4個(gè)過(guò)程。首先使用苯異硫氰酸酯(PITC)在pH9.0的堿性條件下對(duì)蛋白質(zhì)或多肽進(jìn)行處理，PITC與肽鏈的N-端的氨基酸殘基反應(yīng)，形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物，即PTC-肽。
 

　　然后PTC-肽用處理，N-端氨基酸殘基肽鍵被有選擇地切斷，釋放出該氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接下來(lái)將該衍生物用有機(jī)溶劑(例如氯丁烷)從反應(yīng)液中萃取出來(lái)，而去掉了一個(gè)N-端氨基酸殘基的肽仍留在溶液中。
 

　　萃取出來(lái)的噻唑啉酮苯胺衍生物不穩(wěn)定，經(jīng)酸作用，再進(jìn)一步環(huán)化，形成一個(gè)穩(wěn)定的苯乙內(nèi)酰硫脲(PTH)衍生物，即PTH-氨基酸。留在溶液中的減少了一個(gè)氨基酸殘基的肽再重復(fù)進(jìn)行上述反應(yīng)過(guò)程，整個(gè)測(cè)序過(guò)程現(xiàn)在都是通過(guò)測(cè)序儀自動(dòng)進(jìn)行